Все стадии производства антибиотиков – технологии, сырье, фильтрация и очистка

Автор: | 25.01.2022
Нет комментариев

Антибиотики (АТБ) – химиотерапевтические препараты, избирательно угнетающие рост и развитие патогенных бактерий, микроскопических грибков и опухолевых клеток; не активны в отношении вирусов. Открыты в 1928 году британским бактериологом А. Флемингом. Лекарственные формы с антибиотиками спасли миллионы жизней, особенно во время Второй мировой войны.

По способу получения подразделяют на:

  • природные – синтезируемые микроорганизмами (более 80 % известных АТБ выделяют актиномицеты, реже – бактерии, растения и животные);
  • полусинтетические – модифицированные природные молекулы с целью расширения спектра активности или снижения токсичности;
  • синтетические – аналоги природных АТБ, синтезируемые химическим путём.

В настоящее время клиническая фармакология различных групп антибиотиков – предмет активного изучения зарубежными и отечественными учёными. Расширяется пул данных о механизмах активности, источниках и спектре чувствительных микроорганизмов.

Отличительные особенности биотехнологического синтеза



Производство антибиотиков состоит из 3 стадий:

1

Выделение штамма-продуцента антибиотиков из естественных мест обитания, как правило, это обитатели почвы. Возможность выделения антагонистически активных молекул – генетически запрограммирована. Один вид продуцирует не более 2 специфичных АТБ.

С эволюционной точки зрения надобность в широком перечне различных бактерицидных агентов исключена, так как для каждого вида характерно своё место обитания и потребность в угнетении жизнедеятельности конкретных конкурентов. Кроме того, один и тот же штамм бактерий при различных условиях культивирования синтезирует различное количество определённого антибактериального вещества.

Изменение условий культивирования определяют возможность преимущественного получения одного специфического продукта или его новой формы, однако, исключительно в рамках продуцируемых соединений конкретного вида.

2

Биотехнологическая стадия. Установлено, что изменение химико-физических параметров среды культивирования оказывает непосредственное влияние на способность синтеза АТБ:

  • состав питательной среды: мясо-пептонная, картофельная или кукурузная. Главный недостаток натуральных составов – неизвестен точный химический набор компонентов, поэтому преимущественное применение получили синтетические питательные среды с фиксированным количеством и набором элементов;
  • для определённого продуцента антибиотика подбирается оптимальный уровень рН. Например, актиномицеты растут в диапазоне от 6,7 до 8, а молочнокислые бактерии – от 5,6 до 6;
  • в среднем температурный оптимум для бактерий варьирует от 30 до 37 °С, но встречаются и исключения. Так, Bacillus brevis var. G.- B. – продуцент грамицидина С, растёт при температуре близкой к 40 °С.

3

Очистка и концентрирование готового продукта осуществляется в строгих условиях стерильности. Готовый препарат расфасовывают в упаковки

Потребность в содержании кислорода у продуцентов различных антибиотиков на разных стадиях биотехнологического синтеза может меняться. Не исключено возникновение необходимости в дополнительной аэрации культурального раствора.

Получение антибиотиков не обходится без трудностей, одна из которых – утилизация отходов промышленного биотехнологического производства. Известно, что более половины отходов культурального мицелия сжигаются или сбрасываются в сточные воды, что противоречит правилам экологической безопасности.

Читайте далее: Изобретатель антибиотиков или история спасения человечества

Технологическая сторона

Культивирование – технологический процесс накопления биомассы в питательной среде с целью последующего выделения целевого продукта. Соблюдение всех правил и норм на данной стадии увеличивает выход антибиотика.

В настоящее время широкое распространение приобретает периодическое культивирование штаммов, продуцирующих антибиотики, с восполнением питательных веществ, путём их добавления. Преимущество данной методики заключается в возможности полного контроля над производством на всех стадиях.

Особое место занимает промышленное получение термостабильных антибиотиков. Для их производства используют специальные ферменты, выдерживающие экстремальные уровни нагревания и давления.

Из чего синтезируют сырьё для производства антибиотиков

Рассмотрим сырьё, используемое на стадии подготовки культуральной жидкости и для экскреции чистого бактерицидного вещества:

  • дизэмульгатор применяется с целью разрушения эмульсий. Известно, что нативный раствор при биосинтезе пенициллина включает пептидные и органические примеси, образующие устойчивую дисперсную систему при обработке бутилацетатом, которая существенно затрудняет сепарацию. Наиболее распространено применение контакта Петрова (смесь нефтяных сульфокислот);
  • экстрагенты органического происхождения: бутилацетат для экстракции пенициллина, 2-этилгексанол-1 – тетрациклина, бутанол – концентрат бензилпенициллина и терациклина;
  • ионообменные смолы используются для адсорбции чистого бактерицидного вещества из нативного раствора, нейтрализации субстрата и элюата;
  • активированный уголь эффективно осветляет растворы полученных антимикробных веществ;
  • другие химические вещества: минеральные кислоты и щёлочи – подкисление нативных растворов и удаление адсорбированного стрептомицина; удаление излишнего количества пептидов и органических оснований из культуральной жидкости; антисептики.

Важно, чтобы сырье для производства антибиотиков соответствовало стандартам качества и было полностью стерильно.

Подготовка инокулята

Согласно технологии производства посевной материал проходит 2 подготовительных этапа:

  1. культивирование посевного мицелия 1 генерации осуществляется в инокуляторах;
  2. накопление посевного мицелия 2 генерации проводится в больших по объёму устройствах.

Споры антибиотических продуцентов предварительно выращивают в сосудах из стекла на зёрнах пшеницы, а затем подсушивают на воздухе. В таком состоянии споровая культура может храниться длительное время в температурном режиме от 20 до 25 °С.

Главная задача выращивания мицелия с целью последующего посева – извлечение как можно большего количества культуры клеток, обеспечивающей максимальный выход целевого продукта. Для этого продуцирующие штаммы выращивают на агарах с легкодоступными питательными компонентами в оптимальных условиях.

Длительность роста продуцентов не превышает 50 часов. Затем 10 % мицелия из инокулятора помещают в посевной аппарат на 12-18 часов, после чего 20 % полученной культуры поступает в ферментеры.

Читайте далее: Узнайте о современной классификации антибиотиков по группе параметров

Биотехнологическая ферментация

Процесс ферментации – главная стадия в биотихнологическом получении антибиотических веществ.

Химический набор макро- и микроэлементов подбирается с учётом требований продуцирующей культуры. Наиболее эффективный биосинтез отмечается, если культура в ходе потребления питательных веществ и выделения продуктов клеточного метаболизма, одновременно формирует необходимые условия для перехода от роста мицелия к этапу образования АТБ. Длительность второго по продолжительности должна быть максимальной и протекать до аутолиза клеток.

С этой целью в культуральную жидкость одновременно добавляют легко- (глюкоза, гидрол) и трудноусваиваемые (лактоза) сложные углеводы. Первые необходимы для быстрого роста и накопления большей биомассы, а вторые – создают условия для биосинтеза антибиотических средств. Установлено, что лактоза – единственный из всех известных углеводов, при котором происходит полноценный синтез пенициллина.

Обязательный компонент в составе культуральной смеси для ферментации – минеральный азот, источником которого выступают аммиачная селитра или сульфат аммония. Важно: совокупность всех процессов биосинтеза микроскопических грибов приводит к изменению рН в кислую сторону, поэтому необходимо добавлять щелочные растворы.

Фосфор принимает участие в метаболизме про- и эукариотических клеток, он также необходим для инициации антибиотикообразования. Оптимальная концентрация фосфора варьирует у различных продуцентов. Например, получение пенициллина требует присутствия высокого уровня фосфора в составе культурального раствора, а рост самого гриба-продцуента осуществляется при низких концентрациях.

Сера – неизменный компонент всех питательных сред. Данное правило обусловлено тем, что химический элемент входит в состав незаменимых аминокислот, ферментов и некоторых АТБ (цефалоспорин, пенициллин).



Важно отменить корреляцию между составом культуральной среды и требуемым уровнем аэрации. При увеличении концентрации питательных компонентов происходит активный рост биомассы, соответственно увеличивается и потребность в кислороде. Установлено, что производство антибиотиков наиболее эффективно на богатых средах в условиях повышенного уровня аэрации.

Необходимо строго соблюдать правила асептики в ходе биосинтеза. Посторонняя микрофлора значительно снижает количество получаемого продукта за счёт угнетения роста штаммов-продуцентов и выработке ферментов, разрушающие его. Необходимо обеспечивать полную стерильность не только нативного раствора, питательной среды, но и технологических аппаратов.

Читайте далее: Будущее уже наступило или список новейших антибиотиков широкого спектра действия


Фильтрация

Стандартная методика разделения мицелия от культуральной жидкости – барабанный вакуумный фильтр непрерывного действия. Фильтрация запускается с момента старта аутолиза клеток мицелия. Данный факт объясняется тем, что если фильтровать уже автолизированную культуру, то затраты по времени увеличатся в несколько раз. Так как разрушенные клетки мицелия не способны формировать плотное покрытие на фильтрующем барабане, а налипают как отдельные комки, то их очищение в зоне «отдувки» затруднено.

Несоблюдение правил биотехнологического получения пенициллина приведёт к его деградации при фильтрации. Необходимо охлаждать исходный раствор  для культивирования до 4-6°С и дезинфицировать фильтры после каждой загрузки.

Характеристика и подготовка нативного раствора

К основным характеристикам относят:

  • цвет варьирует от жёлтого до зелено-коричневого;
  • рН регулируется в соответствии с потребностями микроорганизмов, в среднем от 6, 5 до 8;
  • высокая концентрация белковых компонентов.

Различают различные методики подготовки нативных жидкостей для очищения от примесей: осаждение солями металла, температурная или фенольная коагуляция. Отмечено, что в ходе очищающих реакций происходит потеря до 15 % целевого продукта.

Экстракция и очистка АТБ

Химический состав нативной жидкости: сухие вещества – до 6 %; минеральные компоненты – до 40 %; пенициллин – до 30 %; остальное – смесь примесей (пептиды, пигменты и органические кислоты).

Очистка пенициллина осуществляется 3 методиками:

  • адсорбция – повышение уровня концентрации целевого вещества на поверхности разделения твёрдой и конденсированной фазы, которая возникает как результат отсутствия компенсации силы взаимодействия между молекулами на разделе фаз;
  • экстракция – выделение чистого продукта из культуральной жидкости при помощи специального экстрагента. При выборе экстрагента важно учитывать его химико-физические свойства, препятствующие смешиванию со смесью для очистки;
  • осаждение молекул АТБ путём формирования нерастворимого осадка в ходе химической реакции при внесении в смесь дополнительных реагентов.

Получение антибиотиков в промышленных масштабах предполагает использование метода экстракции, при этом в ходе реакции в экстрагент входит более 80 % от исходного количества из нативной жидкости. Важно, чтобы всё очищение было непрерывным.

Очищение кристаллической соли АТБ

Рассмотрим на примере наиболее популярного и масштабно получаемого АТБ – пенициллина. Основной метод, гарантирующий выход наиболее чистого пенициллина – экстракция бензилпенициллина в виде калиевой соли, с процессом последующего упаривания под вакуумом. В результате происходит кристаллизация калиевой соли бензилпенициллина.

Стадии очищения:

  1. дегидротация экстракта бутилацетата при температуре 18 °С;
  2. фильтрация от льда активированным углём;
  3. выделение калиевой соли бензилпенициллина гидроксидом калия;
  4. стерилизация и упаривание под вакуумом в антисептических условиях;
  5. применение фильтрующей центрифуги и промывка в несколько стадий бутанолом;
  6. грануляция и сушка полученной соли.

Одно из важнейших требований – абсолютная стерильность полученного продукта. При этом обработки высокой температурой недостаточно для этого. Необходимо соблюдать строгую асептику на всех этапах производства и очистки.

Читайте далее: Уникальные данные о совместимости антибиотиков между собой в таблицах

Юлия Пешкова